Иоганн стал магистром (искусств) в 18 лет, перешёл на изучение медицины, но одновременно увлёкся математикой (хотя медицину не бросил). Вместе с братом Якобом изучает первые статьи Лейбница о методах дифференциального и интегрального исчисления, начинает собственные глубокие исследования.

1691: будучи во Франции, пропагандирует новое исчисление, создав первую парижскую школу анализа. По возвращении в Швейцарию переписывается со своим учеником маркизом де Лопиталем, которому оставил содержательный конспект нового учения из двух частей: исчисление бесконечно малых и интегральное исчисление.

В качестве концептуальной основы действий с бесконечно малыми Иоганн сформулировал в начале лекций три постулата (первая попытка обоснования анализа):

1. Величина, уменьшенная или увеличенная на бесконечно малую величину, не уменьшается и не увеличивается.

2. Всякая кривая линия состоит из бесконечно многих прямых, которые сами бесконечно малы.

3. Фигура, заключенная между двумя ординатами, разностью абсцисс и бесконечно малым куском любой кривой, рассматривается как параллелограмм.

Позже Лопиталь при издании своего учебника отбросил 3-й постулат как излишний, вытекающий из первых.

В этом же 1691 г. появился первый печатный труд Иоганна в Acta Eruditorum: он нашёл уравнение «цепной линии» (из-за отсутствия в то время показательной функции построение выполнялось через логарифмическую функцию). Одновременно подробное исследование кривой дали Лейбниц и Гюйгенс.

1692: получено классическое выражение для радиуса кривизны кривой.

1693: подключился к переписке брата с Лейбницем.

1694: женился; защитил докторскую диссертацию по медицине. В ответ на письмо Лопиталя сообщает ему метод раскрытия неопределённостей, известный сейчас как «правило Лопиталя».

Печатает в Acta Eruditorum статью «Общий способ построения всех дифференциальных уравнений первого порядка». Здесь появились выражения «порядок уравнения» и «разделение переменных» — последним термином Иоганн пользовался еще в своих парижских лекциях. Выражая сомнение в сводимости любого уравнения к виду с разделяющимися переменными, Иоганн предлагает для уравнений первого порядка общий прием построения всех интегральных кривых при помощи изоклин в определяемом уравнением поле направлений.

1695: По рекомендации Гюйгенса становится профессором математики в Гронингене.

1696: Лопиталь выпускает в Париже под своим именем первый в истории учебник по математическому анализу: «Анализ бесконечно малых для исследования кривых линий» (на французском языке), в основу которого была положена первая часть конспекта Бернулли.

Значение этой книги для распространения нового учения трудно переоценить — не только потому, что она была первой, но и благодаря ясному изложению, прекрасному слогу, обилию примеров. Как и конспект Бернулли, учебник Лопиталя содержал множество приложений; собственно, они занимали львиную долю книги — 95 %.

Практически весь изложенный Лопиталем материал был почерпнут из работ Лейбница и Иоганна Бернулли (авторство которых в общей форме было признано в предисловии). Кое-что, впрочем, Лопиталь добавил и из своих собственных находок в области решения дифференциальных уравнений.

Объяснение этой необычной ситуации — в материальных затруднениях Иоганна после женитьбы .

Двумя годами ранее, в письме от 17 марта 1694 г. Лопиталь предложил Иоганну ежегодную пенсию в 300 ливров, с обещанием затем ее повысить, при условии, что Иоганн возьмет на себя разработку интересующих его вопросов и будет сообщать ему, и только ему, свои новые открытия, а также никому не пошлет копии своих сочинений, оставленных в свое время у Лопиталя.

Этот необычный контракт пунктуально соблюдался 2 года, до издания книги Лопиталя. Позднее Иоганн Бернулли — сначала в письмах к друзьям, а после смерти Лопиталя (1704) и в печати — стал защищать свои авторские права.

Книга Бернулли-Лопиталя имела оглушительный успех у самой широкой публики, выдержала четыре издания (последнее — в 1781 году), обросла комментариями, была даже (1730) переведена на английский, с заменой терминологии на ньютоновскую (дифференциалов на флюксии и т. п.). В Англии первый общий учебник по анализу вышел только в 1706 г. (Диттон).

1696: Иоганн публикует задачу о брахистохроне: найти форму кривой, по которой материальная точка быстрее всего скатится из одной заданной точки в другую. Ещё Галилей размышлял на эту тему, но ошибочно полагал, что брахистохрона — дуга окружности.

Это была первая в истории вариационная задача, и математики с ней блестяще справились. Иоганн сформулировал задачу в письме Лейбницу, который тотчас её решил и посоветовал выставить на конкурс. Тогда Иоганн опубликовал её в Acta Eruditorum. На конкурс пришли три решения, все верные: от Лопиталя, Якова Бернулли и (анонимно опубликовано в Лондоне без доказательства) от Ньютона. Кривая оказалась циклоидой. Своё собственное решение Иоганн тоже опубликовал.

1699: вместе с Якобом избран иностранным членом Парижской Академии наук.

1702: совместно с Лейбницем открыл приём разложения рациональных дробей на сумму простейших.

1705: вернулся в Базельский университет, профессором греческого языка.

1708 После смерти брата Якоба (1705) приглашается на его кафедру в Базеле и занимает её до самой смерти (1748).

Другие научные заслуги: Иоганн Бернулли поставил классическую задачу о геодезических линиях и нашел характерное геометрическое свойство этих линий, а позднее вывел их дифференциальное уравнение. Необходимо также отметить, что он воспитал множество учеников, среди которых — Эйлер и Даниил Бернулли.

К его портрету Вольтер написал четверостишие:

Его ум видел истину,
Его сердце познало справедливость.
Он — гордость Швейцарии
И всего человечества.

В честь Якоба и Иоганна Бернулли назван кратер на Луне.